Разработка мультиплексной ПЦР-РВ на основе анализа кривых плавления с высоким разрешением (HRM) для выявления вирусов PEDV, TGEV, PoRV, PDCoV, PRV и PRRSV
Шесть основных вирусных патогенов — вирус эпидемической диареи свиней (PEDV), вирус трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV), ротавирус свиней (PoRV), дельтакоронавирус свиней (PDCoV), вирус псевдобешенства (PRV) и вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV) — наносят значительный экономический ущерб мировому свиноводству. Частая коциркуляция данных возбудителей и обусловленные ими смешанные инфекции существенно затрудняют проведение быстрой и точной диагностики.
Для преодоления указанного ограничения была разработана мультиплексная ПЦР-РВ в реальном времени, интегрированная с анализом кривых плавления с высоким разрешением (High-Resolution Melting, HRM), позволяющая осуществлять одновременную детекцию и дифференциацию шести перечисленных вирусов. Сконструированы и оптимизированы специфические праймеры, нацеленные на консервативные участки генов PEDV-M, TGEV-N, PoRV-VP6, PDCoV-M, PRV-gE и PRRSV-ORF5. Проведена оптимизация условий амплификации и параметров HRM-анализа, обеспечивающая специфичную амплификацию и формирование характерных профилей плавления для всех шести вирусов.
Разработанный метод продемонстрировал высокую специфичность при отсутствии перекрёстных реакций с другими распространёнными патогенами свиней. Пределы детекции (ПД) составили 10 копий/мкл для пяти вирусов (PEDV, TGEV, PoRV, PDCoV, и PRRSV) и 100 копий/мкл для PRV. Эффективность амплификации варьировала от 90 до 102% (R² ≥ 0,98). Высокая воспроизводимость метода подтверждена коэффициентами вариабельности внутри- и межсерийных анализов: <3% для значений порогового цикла (Ct) и <0,5% для значений температуры плавления (Tm).
Клиническая апробация на 248 полевых образцах показала, что частота детекции шести патогенов с использованием разработанного метода была на 16,0–27,3% (в среднем на 18,1%) выше по сравнению с результатами, полученными при применении стандартных ПЦР-методов.
В совокупности полученные данные подтверждают, что разработанный мультиплексный ПЦР-РВ-анализ с HRM-детекцией представляет собой быстрый, чувствительный, специфичный и высоковоспроизводимый инструмент для выявления и дифференциации основных вирусных патогенов свиней. Данная методология формирует ценную молекулярно-диагностическую платформу, обеспечивающую раннюю диагностику, эпизоотологический надзор и усиленный контроль вирусных болезней свиней.
