Разработка и валидация мультиплексной ОТ-ПЦР-РВ на основе LNA-олигонуклеотидов для дифференциации Betaarterivirus europensis (РРСС-1), Betaarterivirus americense (РРСС-2) и высокопатогенной линии L8 вируса РРСС-2
Вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) – высоковариабельный артеривирус, наносящий значительный экономический ущерб мировому свиноводству. Эффективный надзор и программы эрадикации, реализуемые во многих странах, требуют применения надежных молекулярно-диагностических методов, которые необходимо периодически адаптировать к появлению новых генетических вариантов возбудителя.
Существующие диагностические подходы имеют ограничения. Классическое вирусологическое исследование медленно и зависит от штамма, серологические методы (ИФА) позволяют обнаружить вирус лишь через несколько недель после инфицирования, не обеспечивая дифференциации между видами/штаммами РРСС и не различая постинфекционный и поствакцинальный иммунитет. Наиболее распространённым методом является количественная ОТ-ПЦР в реальном времени благодаря быстроте и высокой аналитической чувствительности, однако его эффективность также ограничена при работе с высоковариабельными штаммами.
В представленной статье разработан и валидирован метод одностадийной мультиплексной ОТ-ПЦР в реальном времени для одновременного выявления и дифференциации Betaarterivirus europensis (РРСС-1), Betaarterivirus americense (РРСС-2) и высокопатогенной линии L8 РРСС-2, а также РНК-внутреннего контрольного образца в одной реакции. Для повышения специфичности и обеспечения мультиплексной детекции сконструированы короткие LNA-модифицированные зонды, нацеленные на консервативные, но дискриминаторные последовательностные мотивы.
Аналитическая эффективность оценена с использованием сыворотки крови свиней, искусственно контаминированной целевыми последовательностями, естественно положительных образцов, а также путём независимого лабораторного тестирования в сравнении с коммерческим реагентом-компаратором. Метод продемонстрировал превосходную линейность, низкие пределы обнаружения (LoD95), устойчивость к типичным процедурным отклонениям, стабильность реагентов и полное качественное согласие с компаратором. Короткие LNA-зонды в консервативных дискриминаторных локусах повысили специфичность и позволили реализовать мультиплексирование.
Таким образом, разработанный метод LNA-мультиплексной ОТ-ПЦР в реальном времени представляет собой чувствительный, специфичный и удобный в эксплуатации инструмент для программ надзора и контроля РРСС. В дальнейшем планируется расширить валидацию на другие типы образцов, приборы и географические регионы, а также внедрить непрерывный мониторинг эволюции вируса для своевременного обновления праймеров и зондов.
