Разработка внутриклеточного иммуноферментного анализа для титрования вируса РРСС с использованием моноклональных антител к его нуклеокапсидному белку
Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС), вызываемый вирусом РРСС, представляет собой высокопатогенное заболевание, наносящее значительный экономический ущерб свиноводству. Клинически патология проявляется репродуктивными нарушениями у свиноматок (включая аборты и мертворождения) и респираторными симптомами у особей всех возрастных групп. Несмотря на почти 40-летнюю историю изучения с момента первого выявления в 1980-х годах, полный контроль над РРСС отсутствует, что обусловлено высокой частотой мутаций вируса, его иммуносупрессивным действием и сложными механизмами патогенеза.
Точная диагностика вируса РРСС является критически важным условием для эффективной профилактики и контроля данного заболевания. Разработан широкий спектр методов выявления антигенов и антител к вирусу РРСС. Определение титра вируса in vitro представляет собой стандартную и обязательную задачу в исследовательской практике при изучении вируса. Наиболее распространёнными подходами для титрования вируса РРСС служат образование бляшек, анализ 50% инфекционной дозы в культуре клеток (TCID50) и количественная ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
Традиционные методы титрования, основанные на определении 50% инфекционной дозы в культуре клеток (TCID50) с визуальным учётом цитопатического действия (ЦПД), характеризуются субъективностью и низкой воспроизводимостью. Это обусловлено вариабельностью проявления ЦПД и зависимостью результатов от опыта исследователя. Альтернативные методы, такие как метод образования бляшек и ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), также имеют ограничения. ОТ-ПЦР не позволяет дифференцировать инфекционные и неинфекционные вирионы. Метод TCID50, несмотря на свою простоту и экономическую эффективность, остаётся субъективным, поскольку корректная идентификация ЦПД в значительной степени зависит от квалификации исследователя. Более того, на проявления ЦПД могут существенно влиять такие факторы, как физиологическое состояние клеточной культуры и патогенные свойства различных штаммов вируса. Это затрудняет оценку ЦПД и в конечном счёте снижает точность определения титра вируса.
Для устранения указанных недостатков разработан внутриклеточный иммуноферментный анализ (ИФА), проводимый непосредственно в 96-луночных планшетах без выделения клеток линии MARC-145. В его основе лежат моноклональные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена и направленные против высококонсервативного нуклеокапсидного (N) белка вируса РРСС. Оптимизированный метод демонстрирует специфичность 98,39%, чувствительность 100% при отношении сигнал/шум 1,50 и отсутствие перекрёстных реакций с вирусом эпидемической диареи свиней (ВЭДС), также реплицирующимся в клетках MARC-145. Площадь под ROC-кривой составляет 0,9985, что подтверждает высокую диагностическую точность. Практическая значимость метода подтверждена скринингом противовирусного соединения 25(OH)D3.
Разработанный внутриклеточный ИФА позволяет избежать ошибок, связанных с визуальной оценкой ЦПД, и обеспечивает объективное, стандартизованное и воспроизводимое титрование инфекционного вируса РРСС. Метод пригоден как для рутинного вирусологического контроля, так и для серийного скрининга противовирусных препаратов, представляя собой надёжную альтернативу традиционному TCID50.
