Разработка и валидация метода двойной флуоресцентной изотермической ферментативной рекомбиназной амплификации для быстрой дифференциации вируса РРСС-1 и РРСС-2
Вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) представляет собой один из ключевых патогенов, оказывающий существенное негативное воздействие на экономическую стабильность мировой свиноводческой отрасли. Два генотипа данного вируса — РРСС-1 (Европейский тип) и РРСС-2 (Североамериканский тип) — демонстрируют значительные различия в генетических характеристиках и эпидемиологических параметрах. В последнее время наблюдается все более частое сообщение о случаях коинфекции и совместной циркуляции этих генотипов. Параллельно с этим, процессы вирусной рекомбинации продолжают оказывать влияние на эволюцию РРСС. В совокупности вышеуказанные факторы повышают необходимость в разработке и внедрении методов быстрой и точной дифференциальной диагностики.
В исследовании представлена разработка и систематическая оптимизация метода двойной флуоресцентной амплификации на основе ферментативной рекомбиназы (ERA — Enzymatic Recombinase Amplification), предназначенного для одномоментной идентификации вирусов РРСС-1 и РРСС-2. В качестве мишеней для амплификации выбраны высококонсервативные локусы гена ORF7, характерные для обоих генотипов. Сконструированы и валидированы генотип-специфичные олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды с дифференцированными репортерными метками. Посредством ортогонального дизайна эксперимента проведена оптимизация температурного режима реакции и соотношения объемов праймеров и зондов, что обеспечило эффективную синхронную амплификацию обеих матриц в изотермических условиях (42 °C).
Разработанный метод продемонстрировал высокий уровень аналитической специфичности по отношению к РРСС-1 и РРСС-2. Пределы детекции (LoD) составили 10² копий/мкл для РРСС-1 и 10 копий/мкл для РРСС-2. В ходе клинической апробации общая степень совпадения результатов достигла 98,78 %.
Предложенный подход — метод двойной флуоресцентной амплификации с использованием рекомбиназы — характеризуется быстротой реакции, технологической простотой, повышенными показателями чувствительности и специфичности. Метод позволяет надежно дифференцировать два генотипа РРСС без привлечения сложного аналитического оборудования, выступая в качестве практического и эффективного инструмента для быстрой диагностики, эпидемиологического мониторинга и контроля РРСС.
ссылка на публикацию
В исследовании представлена разработка и систематическая оптимизация метода двойной флуоресцентной амплификации на основе ферментативной рекомбиназы (ERA — Enzymatic Recombinase Amplification), предназначенного для одномоментной идентификации вирусов РРСС-1 и РРСС-2. В качестве мишеней для амплификации выбраны высококонсервативные локусы гена ORF7, характерные для обоих генотипов. Сконструированы и валидированы генотип-специфичные олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды с дифференцированными репортерными метками. Посредством ортогонального дизайна эксперимента проведена оптимизация температурного режима реакции и соотношения объемов праймеров и зондов, что обеспечило эффективную синхронную амплификацию обеих матриц в изотермических условиях (42 °C).
Разработанный метод продемонстрировал высокий уровень аналитической специфичности по отношению к РРСС-1 и РРСС-2. Пределы детекции (LoD) составили 10² копий/мкл для РРСС-1 и 10 копий/мкл для РРСС-2. В ходе клинической апробации общая степень совпадения результатов достигла 98,78 %.
Предложенный подход — метод двойной флуоресцентной амплификации с использованием рекомбиназы — характеризуется быстротой реакции, технологической простотой, повышенными показателями чувствительности и специфичности. Метод позволяет надежно дифференцировать два генотипа РРСС без привлечения сложного аналитического оборудования, выступая в качестве практического и эффективного инструмента для быстрой диагностики, эпидемиологического мониторинга и контроля РРСС.
ссылка на публикацию
