Быстрая дифференциация жизнеспособного и инактивированного вируса африканской чумы свиней методом количественной ПЦР
Африканская чума свиней (АЧС) представляет собой высококонтагиозное геморрагическое заболевание, поражающее домашних свиней и диких кабанов. Глобальное распространение болезни привело к огромным экономическим потерям в свиноводстве.
Вирусная этиология АЧС характеризуется сложной экологией передачи, включающей разнообразные механизмы как внутри популяций свиней, так и между ними. Основные пути передачи включают непосредственный контакт с инфицированными животными. Непрямая передача осуществляется через различные объекты, такие как зараженные корма, источники воды, продукты из свинины и оборудование. Механическое распространение вируса также происходит посредством перемещения персонала и транспортных средств. На текущий момент не существует доступных безопасных и эффективных вакцин или специфических методов лечения АЧС, что подчеркивает значимость мер биобезопасности в контексте контроля и предотвращения вспышек заболевания. В пострадавших странах и регионах основные меры контроля включают выявление инфицированных особей, проведение дезинфекции и выбраковку.
Метод количественной ПЦР в реальном времени (qPCR) является широко распространённым инструментом для детекции вируса АЧС. Однако он не способен дифференцировать жизнеспособные вирионы от инактивированных частиц, поскольку в последних зачастую сохраняются нуклеиновые кислоты. Это ограничение может приводить к ложному завышению вирусной нагрузки в исследуемых образцах, что, в свою очередь, провоцирует избыточные меры по реагированию на вспышки инфекции и сопряжено с увеличением экономических затрат.
Для решения данной проблемы был разработан метод анализа жизнеспособности вируса АЧС с применением количественной ПЦР (V-qPCR) с интеркалирующими красителями нуклеиновых кислот, такими как пропидий моноазид (PMA) или этидий моноазид (EMA). Эти красители специфически проникают через поврежденную вирусную оболочку инактивированных вирионов, ковалентно связываются с вирусной ДНК и препятствуют амплификации в процессе ПЦР.
Результаты оптимизированного анализа методом V-qPCR показали предел обнаружения вируса АЧС в концентрации 101,5 ТЦД50/мл. Метод продемонстрировал высокую специфичность, эффективно различая химически инактивированные образцы вируса, обработанные пероксимоносульфатом калия (PPMS), гидроксидом натрия (NaOH) или уксусной кислотой (HAc). В этих образцах амплификация нуклеиновых кислот не была зарегистрирована.
В рамках экспериментального исследования были проанализированы образцы окружающей среды, содержащие вирус АЧС, которые были взяты с различных поверхностей, включая стены, рейки, корм, пол, мочу и фекалии. Метод V-qPCR продемонстрировал надежную детекцию инактивации вируса в образцах, подвергшихся обработке PPMS (на поверхностях стен, реек, в моче и фекалиях), а также в образцах, обработанных NAOH (на стенах и в фекалиях). При этом амплификация вирусной ДНК не была обнаружена. В то же время, в образцах, обработанных HAc, была выявлена остаточная амплификация (Ct ~ 31,5), что указывает на более высокую эффективность PPMS и NAOH при применении к сложным матрицам.
В результате проведения исследования с использованием тридцати мазков из окружающей среды, положительных на АЧС, были получены следующие данные:
1. В 21 образце не была обнаружена амплификация, что свидетельствует об инактивации вируса.
2. В 6 образцах значения порогового цикла (Ct) до и после термической обработки имели незначительные различия (ΔCt [Ct(+краситель) – Ct(без красителя)] < 2.5), что также указывает на инактивацию вируса.
3. В 3 образцах были зафиксированы обнаруживаемые значения Ct до термической обработки, однако после проведения процедуры амплификация не наблюдалась, что подтверждает наличие жизнеспособного вируса.
Это исследование представляет собой первое применение V-qPCR для оценки инфекционности вируса АЧС в полевых условиях. Данный метод характеризуется высокой скоростью выполнения и практичностью, что способствует повышению точности диагностических процедур и обеспечению биологической безопасности на свиноводческих предприятиях.
