Сравнительный анализ методов цифровой ПЦР и ПЦР в реальном времени для количественного определения вируса АЧС
Африканская чума свиней (АЧС) – высококонтагиозное вирусное заболевание, наносящее значительный социально-экономический ущерб. В современной лабораторной диагностике ключевую роль играют молекулярные методы. Всемирная организация здравоохранения животных (ВОЗЖ) рекомендует для надежного выявления вируса АЧС два высокоспецифичных протокола ПЦР в реальном времени (qPCR) – P1 и P2. Целью данного исследования являлась разработка и сравнительная валидация методов капельной цифровой ПЦР (ddPCR) третьего поколения для детекции вируса АЧС с использованием тех же наборов праймеров/зондов.
В результате были разработаны два протокола ddPCR на основе праймерно-зондовых систем, рекомендованных ВОЗЖ для qPCR (P1 и, впервые для ddPCR, P2). В ходе стандартизации определены оптимальные концентрации реагентов и температуры отжига для каждого анализа. Для оценки аналитических характеристик (линейности, динамического диапазона, предела обнаружения – LOD и предела количественного определения – LOQ) использовали серийные разведения плазмидной ДНК, содержащей ген VP72 вируса АЧС. Проведено сравнение с рутинными qPCR-протоколами. Аналитическая специфичность и применимость подтверждены тестированием клинических образцов различного происхождения.
Оптимизированные протоколы ddPCR продемонстрировали высокую аналитическую чувствительность, сопоставимую или превосходящую таковую у референсных методов qPCR. Оба метода ddPCR показали широкий динамический диапазон и высокую линейность, позволяя проводить абсолютное количественное определение без необходимости построения калибровочных кривых. При анализе клинических образцов, включая образцы с низкой вирусной нагрузкой, ddPCR показала высокую степень согласованности с qPCR, подтвердив свою надежность.
Разработанные двухпротокольные анализы ddPCR представляют собой надежную и высокочувствительную альтернативу qPCR для диагностики АЧС, что особенно актуально для выявления низких концентраций вируса. Данные методы являются ценным инструментом для мониторинга вспышек, оценки эффективности вакцин (за счет точного измерения виремии) и могут найти применение в рамках концепции «Единое здоровье» при анализе сложных матриц (корма, объекты окружающей среды).
Хотя высокая стоимость и ограничения по пропускной способности в настоящее время могут сдерживать широкое внедрение ddPCR в рутинную практику лабораторий с ограниченными ресурсами, технологическое развитие и анализ малых серий образцов способны нивелировать эти ограничения. Высокая аналитическая чувствительность ddPCR оправдывает ее применение в качестве референсного или подтверждающего метода в комплексной системе диагностики АЧС.
